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  • PCR反應的循環參數

    日期:2024-05-21 00:35
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    摘要:PCR反應的循環參數: 1. 預變性(Initial denaturation) 模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。 2. 循環中的變性步驟 循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列全變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間,變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹di,易造成擴增失敗。 3. 引物退火(Primer annealing) 退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預...
    PCR反應的循環參數:
     
    1.  預變性(Initial denaturation)

    模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

    2.  循環中的變性步驟

    循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列全變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間,變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹di,易造成擴增失敗。

    3.  引物退火(Primer annealing)

    退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。

    退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

    4.  引物延伸

    引物延伸一般在72℃進行(Taq酶合適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略

    延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。

    5.  循環數

    大多數PCR含25-40循環,過多易產生非特異擴增。

    6.  終點延伸

     終點一個循環后,反應在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸全,并使單鏈產物退火成雙鏈。
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